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边帅,赵月,李芳宇,等. 自噬检测质粒pLVX-mRFP-EGFP-LC3的构建和表达鉴定[J]. 科学技术与工程, 2019, 19(33): 101-104.
BIAN Shuai,ZHAO Yue,LI Fang-yu,et al.Construction and Expression Identification of Autophagy Detection Plasmid pLVX-mRFP-EGFP-LC3[J].Science Technology and Engineering,2019,19(33):101-104.
自噬检测质粒pLVX-mRFP-EGFP-LC3的构建和表达鉴定
Construction and Expression Identification of Autophagy Detection Plasmid pLVX-mRFP-EGFP-LC3
投稿时间:2019-03-23  修订日期:2019-08-16
DOI:
中文关键词:  自噬 慢病毒载体 双荧光标签 LC3
英文关键词:autophagy lentiviral vector Double fluorescent label LC3
基金项目:中国博士后科学基金资助项(No.2017M621181);吉林省青年人才托举工程项目(181910)
              
作者单位
边帅 长春中医药大学吉林省人参科学研究院
赵月 长春中医药大学吉林省人参科学研究院
李芳宇 长春中医药大学吉林省人参科学研究院
赵大庆 长春中医药大学吉林省人参科学研究院
王佳雯 长春中医药大学吉林省人参科学研究院
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中文摘要:
      细胞自噬的机体重要的一种代谢过程,为了更好的研究不同条件下细胞自噬的水平,构建自噬检测质粒pLVX-mRFP-EGFP-LC3。使用Trizol法提取Hela细胞总RNA,PCR技术特异性扩增LC3基因,将目的片段插入pEGFP-N3载体中。再将mRFP片段插入到EGFP-LC3质粒中,利用PCR技术扩增带有不同酶切位点的mRFP-EGFP-LC3片段,插入到慢病毒载体pLVX-puro中。通过Fugene? 6将质粒瞬时转染到293T细胞中,使用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达,使用western blotting检测目的基因的表达。结果显示成功构建自噬检测质粒pLVX-mRFP-EGFP-LC3,荧光显微镜下可见红色和绿色荧光,western blotting方法检测到LC3的表达。为进一步研究细胞自噬奠定了基础。
英文摘要:
      The autophagy is an important metabolic process. In order to better study autophagy under different conditions, an autophagy detection plasmid pLVX-MRFP-EGFP-LC3 was constructed. The total RNA of Hela cells was extracted by Trizol. LC3 fragment was specifically amplified by PCR technique, and then inserted into the plasmid pEGFP-N3 vector. The mRFP fragment was inserted into the EGFP-LC3 plasmid, and the mRFP-EGFP-LC3 fragment with different restriction sites was amplified by PCR and inserted into the lentiviral vector pLVX-puro. The plasmid was transiently transfected into 293T cells with Fugene?6. The expression of the fluorescent protein was detected by fluorescence microscope. The expression of the target gene was detected by western blotting. The results showed that the autophagy detection plasmid pLVX-mRFP-EGFP-LC3 was successfully constructed. Red and green fluorescence were observed under fluorescence microscope. The expression of LC3 was detected by western blotting. This study laid the foundation for further study of autophagy.
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